ÁP DỤNG KỸ THUẬT ARMS-PCR TRONG CHẨN ĐOÁN TRƯỚC VÀ SAU SINH BỆNH BETA THALASSEMIA TẠI BỆNH NHI TRUNG ƯƠNG
Thứ 5, 27-01-2011
Lý Thị Thanh Hà1, Nguyễn Thị Phương Mai1, Nguyễn Thị Mai Hương1, Ngô Diễm Ngọc1, Dương Bá Trực1, Nguyễn Thanh Liêm1, Nguyễn Thị Tân Sinh2
1Bệnh Viện Nhi Trung Ương
2Khoa sản, bệnh viện Bạch Mai, Hà Nội
Beta thalassemia là bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường phổ biến nhất thế giới, do đột biến trên gen Hbb gây ra sự giảm hoặc mất tổng hợp chuỗi β globin. Tại Việt Nam, tỷ lệ người mang gen β-thalassemia là 1.5-25% [9]. Mục tiêu: 1.Phát hiện các đột biến gen Hbb trên bệnh nhân beta thalassemia, bước đầu đưa ra tần suất của các đột biến thường gặp. 2. Chẩn đoán trước sinh cho thai phụ có nguy cơ sinh con bị beta thalassemia thể nặng. Đối tượng và phương pháp: 55 mẫu bệnh phẩm máu ngoại vi và 06 mẫu dịch ối từ 16-18 tuần thai của gia đình có nguy cơ sinh con beta thalassemia thể nặng, được sàng lọc đột biến trên gen Hbb bằng kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR và ARMS-PCR. Kết quả: Trong 08 đột biến sàng lọc: CD17(AAG-TAG): 41,6 %, Cd41/42(-TCTT): 34,7 % có tần suất gặp cao nhất , 3/55 mẫu bệnh phẩm không tìm thấy đột biến, 02 thai nhi bị beta thalassemia thể nặng, 04 thai nhi không mang đột biến gen, hoặc là người lành mang gen bệnh. Kết luận: Phát hiện các đột biến trên gen Hbb bằng kỹ thuật ARMS-PCR, bên cạnh ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán trước sinh bệnh β-thalassemia, còn bước đầu đưa ra tần số của các đột biến thường gặp.
Từ khoá: Beta thalassemia, Chẩn đoán trước sinh, ARMS-PCR, Multiplex ARMS-PCR.

I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Beta thalassemia là bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể (NST) thường do đột biến gen β-globin nằm trên cánh ngắn NST 11 qui định, gây giảm hoặc mất tổng hợp chuỗi β globin. Beta thalassemia là một trong những bệnh huyết sắc tố phổ biến nhất, phân bố khắp thế giới [7]. Ở Việt Nam, theo Nguyễn Công Khanh, bệnh β thalassemia là nguyên nhân hàng đầu gây thiếu máu, tan máu nặng ở trẻ em [3]. Tỷ lệ người mang gen bệnh phân bố trong cả nước và khác nhau tùy từng địa phương, từng nhóm dân tộc. Đặc biệt, tỷ lệ mang gen bệnh rất cao ở các dân tộc ít người như: Mông (25%), Catu (14%), Tày (11%), Pako (8.33%) [9].
Cho đến nay, có khoảng hơn 200 đột biến đã được tìm thấy trên gen Hbb[9], xếp vào 2 nhóm: nhóm gây mất hoàn toàn số lượng chuỗi β globin, làm mất chức năng của gen β gây β0 globin và nhóm làm giảm số lượng chuỗi β globin gây β+ globin. Các đột biến này mang tính đặc trưng và phân bố với tỷ lệ khác nhau ở từng dân tộc.
Vùng gen gây đột biến beta thalassemia nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thế 11 (11p15.5), dài 1600bp, gồm 3 exon và 2 intron. Theo một nghiên cứu trên quần thế người Việt Nam của M.L. Saovaros Svasti cho thấy có 8 đột biến gây ra 95% các trường hợp β thalassemia, gồm CD17(AAG-TAG), CD41/42(-TCTT), -28(A>G), CD71/72(+A), IVS1-1(G>T), IVS1-5(G>C), IVS2-654(C>T) và CD26 (GAG>AAG) gây bệnh huyết sắc tố E, là một thể β thalassemia đặc biệt.[9].
Dựa vào biểu hiện lâm sàng, bệnh beta thalasemia chia làm 3 thể chính: thể nhẹ, thể trung gian, thể nặng. Bệnh nhân thể nhẹ dị hợp tử với một đột biến trên gen Hbb gây thiếu máu nhược sắc trên công thức máu, thường không có biểu hiện lâm sàng, cơ thể phát triển bình thường. Bệnh nhân thể nặng hay còn gọi là thể Cooley, đồng hợp tử hoặc dị hợp tử kép hai đột biến khác nhau sẽ bị thiếu máu nặng, phụ thuộc vào việc truyền máu và thải sắt suốt đời.
Bệnh beta Thalasemia được chẩn đoán xác định dựa vào đặc điểm lâm sàng và các xét nghiệm huyết học. Tuy nhiên, các xét nghiệm di truyền phân tử xác định các đột biến trên gen Hbb là điều kiện thiết yếu để thực hiện chẩn đoán trước sinh bệnh beta thalassemia. Vì lý do đó, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu với mục tiêu:
1. Phát hiện các đột biến gen Hbb trên bệnh nhân beta thalassemia, bước đầu đưa ra tần suất của các đột biến thường gặp.
2. Chẩn đoán trước sinh cho thai phụ có nguy cơ sinh con beta thalassemia thể nặng

II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:

1. Đối tượng
55 mẫu máu ngoại vi của bệnh nhân đã được chẩn đoán beta Thalassemia và gia đình bệnh nhân được thu thập từ tháng 6/2008 đến 6/2009. Các bệnh nhân đều là người dân tộc Kinh hiện đang sống tại các tỉnh miền Bắc.
06 mẫu dịch ối của các thai phụ đã có tiền sinh con đầu được chẩn đoán mắc beta Thalassemia.
2. Phương pháp
* Tách chiết ADN:
ADN được tách trực tiếp từ mẫu máu ngoại vi chống đông EDTA và tế bào dịch ối sau nuôi cấy bằng Kit QiaAmp DNA mini kit (Qiagen)
* Mutiplex ARMS-PCR/ ARMS-PCR:
Mutiplex ARMS-PCR và ARMS-PCR là kỹ thuật được sử dụng để sàng lọc các đột biến. Phản ứng này dùng các mồi đặc hiệu có trình tự đầu 3’ bổ sung với alen đột biến và một mồi chung ngược chiều với với mồi đặc hiệu alen [10]. Sự có mặt của đột biến được thể hiện bằng sản phẩm ADN khuếch đại với các kích thước khác nhau đã biết trước. 08 đột biến được chia thành 5 nhóm và được sàng lọc lần lượt như bảng 1 theo nghiên cứu của Hương Lê (2000) trên quần thể người Đông Nam Á [6]. Đột biến được phát hiện qua Multiplex ARMS-PCR, được xác định kiểu gen bằng ARMS-PCR. Riêng đột biến CD26 của HbE được phát hiện trực tiếp bằng ARMS-PCR nếu có HbE + với điện di huyết sắc tố.

III. KẾT QUẢ
Từ tháng 6/2008 đến 6/2009, 27 bệnh nhân đã được chẩn đoán mắc beta Thalassemia tại BV Nhi TƯ, và 6 gia đình có tiền sử sinh con đầu mắc beta Thalassemia bao gồm bố mẹ và con đầu, được tiến hành xét nghiệm di truyền xác định đột biến trên gen Hbb tại Khoa Di truyền và Sinh học phân tử BV Nhi Trung Ương.








IV. BÀN LUẬN:
Ở 27 bệnh nhân beta Thalassemia, 9 trường hợp có kiểu gen dị hợp tử kép 2 đột biến khác nhau hoặc đồng hợp tử với một đột biến trong 8 đột biến sàng lọc, được kết luận mắc beta Thalassemia thể nặng. 18 trường hợp có kiểu gen dị hợp tử với một đột biến. 3 trường hợp không phát hiện thấy đột biến.
Ở 6 gia đình làm chẩn đoán trước sinh, 12 trường hợp là bố hoặc mẹ đều có kiểu gen dị hợp tử với 1 đột biến. Trong 6 trường hợp là con đầu của 6 gia đình, 5 trường hợp có kiểu gen dị hợp tử kép với 2 đột biến khác nhau, 1 trường hợp đồng tử với một đột biến. Trong 6 thai nhi được làm chẩn đoán trước sinh của 6 gia đình trên, 2 thai nhi có kiểu gen dị hợp tử kép với 2 đột biến, được kết luận mắc beta Thalassemia thể nặng, 02 thai nhi có kiểu gen dị hợp tử một đột biến là người lành mang gen bệnh, 02 thai nhi không phát hiện thấy đột biến là người bình thường không mang gen bệnh.
Như vậy, trong tổng số 55 trường hợp máu ngoại vi được sàng lọc với 8 đột biến trên, 52 trường hợp mang ít nhất một alen đột biến trên gen Hbb. Do beta Thalassemia thể nặng có kiểu gen là đồng hợp tử với một đột biến hoặc dị hợp tử kép với hai đột biến từ hai alen khác nhau, nên tỷ lệ đột biến của từng alen có ý nghĩa quan trọng việc tham gia cơ chế gây bệnh.
Alen đột biến CD17 có tỷ lệ cao nhất 41.6%, CD41/42 (-TCTT): 34,7%, HbE (G>A): 12,5%. Tỷ lệ này phù hợp với nghiên cứu của Bùi Văn Viên và cs [1].
Trong 55 trường hợp được sàng lọc với 4 đột biến (CD17; CD1/42; -28; IVS1-1) )ở bước 1, thấy có 3 trường hợp phát hiện đồng hợp tử với một đột biến và 17 trường hợp phát hiện thấy dị hợp tử với 2 đột biến khác nhau, trong đó alen đột biến CD17 và CD41/42 gặp với tỷ lệ cao nhất. Như vậy, chỉ dựa vào bước 1 đã có thể kết luận bệnh mà không cần tiến hành làm các bước tiếp theo. Mặc dù, tỷ lệ đột biến CD71/72 ở bước 4 là 5.6%, cao hơn tỷ lệ đột biến -28 (2.8%) và IVS1-1 (1.4%) của bước 1, nhưng vì đột biến CD71/72 sử dụng mồi chung khác với nhóm đột biến ở bước 1, do đó, đột biến này cần được sàng lọc riêng biệt ở các bước tiếp theo.
Theo phương pháp của Hương Lê và cộng sự, CD71/72 được sàng lọc ở bước 3, sau đột biến IVS1-5. Trong nghiên cứu của chúng tôi, trên 55 trường hợp được sàng lọc, tỷ lệ alen đột biến IVS1-5 là 2.8%, thấp hơn tỷ lệ CD71/72% là 5.6%, do vậy chúng tôi đưa sàng lọc CD71/72 vào bước 2, sau nhóm đột biến bước 1.
Bước thứ 4 sàng lọc alen đột biến IVS2-654. Không có trường hợp nào mang đột biến này trong nghiên cứu của chúng tôi. Tuy nhiên theo các nghiên cứu khác trong các quần thể lân cận như quần thể người Trung Quốc và người Đông Nam Á, alen đột biến IVS2-654 gặp với tỷ lệ khá cao [7]. Do đó, IVS2-654 vẫn được giữ trong nhóm các đột biến chúng tôi sàng lọc, và sẽ có kết luận về tỷ lệ gặp của đột biến này trong các nghiên cứu với cỡ mẫu lớn hơn.
Đột biến alen CD26 của HbE, là một thể bệnh đặc biệt của bệnh beta Thalassemia được xếp vào bước 5 của quá trình sàng lọc, nhưng trên thực tế, đột biến này được sàng lọc riêng biệt, vì HbE là một bệnh lý có sự thay đổi đặc hiệu về điện di huyết sắc tố. Chúng tôi lựa chọn sàng lọc đột biến CD26 đầu tiên nếu bệnh nhân có kết quả điện di huyết sắc tố dương tính với HbE. Trong nghiên cứu của chúng tôi, alen đột biến CD26 gặp với tỷ lệ 12.5%, thấp hơn so các quần thể người Lào, Thái Lan, Campuchia (30%). Điều này có thể do sự phân bố khác nhau giữa các dân tộc, và đối tượng trong nghiên cứu của chúng tôi chủ yếu là người Kinh, trong khi theo nghiên cứu của Bùi Văn Viên, tỷ lệ gặp HbE ở người Mường là trên 30%, tương đương với các nghiên cứu trên.
Trong số các trường hợp được sàng lọc, có 3 trường hợp không phát hiện thấy đột biến nào trong số 8 đột biến trên. Cả ba trường hợp này đều nghi ngờ mắc beta Thalassemia trên lâm sàng và có thay đổi về chỉ số huyết học phù hợp. Đối với những trường hợp này, chúng tôi cần giải trình tự gen Hbb để tìm kiếm các đột biến ít gặp, nằm ngoài nhóm 8 đột biến thường gặp trên. Đây là kỹ thuật chúng tôi đang bước đầu triển khai sau ARMS-PCR, sẽ được đề cập đến trong nghiên cứu tiếp theo.
Xác định kiểu đột biến và kiểu gen trên các bệnh nhân beta Thalassemia và bố mẹ của bệnh nhân là yêu cầu bắt buộc với chẩn đoán trước sinh bệnh beta Thalassemia trong những lần sinh con tiếp theo của những gia đình này. Thời gian thích hợp để tiến hành chẩn đoán trước sinh là khi thai nhi được 16-18 tuần tuổi. Thời điểm này được xem là tương đối muộn ở một số nước trình độ y học phát triển, do người mẹ nguy cơ cao được tiến hành trước sinh ở tuần thai thứ 8-10 với kỹ thuật sinh thiết gai rau. Tuy nhiên, ở Việt Nam, kỹ thuật này chưa được các đơn vị sản khoa áp dụng, do đó, chọc hút dịch ối là phương pháp duy nhất được áp dụng. Mẫu dịch ối sau khi thu thập, được nuôi cấy trong môi trường đặc hiệu của tế bào ối trong khoảng thời gian từ 10 ngày, với mục đích nhân rộng dòng tế bào ối, và loại trừ tế bào máu của người mẹ, là nguyên nhân gây ảnh hưởng đến mức độ chính xác của kết quả. Do đó, thời gian trả kết quả chẩn đoán trước sinh cho bệnh beta Thalassemia thông thường sau 14 ngày kể từ thời điểm chọc ối. Trong số 6 gia đình được làm chẩn đoán trước sinh, có 2 gia đình mà thai nhi được kết luận mắc beta Thalassemia thể nặng. Chúng tôi đã kết hợp với bác sỹ lâm sàng, cũng như các đơn vị sản khoa trong việc tư vấn di truyền đối với các gia đình này.

V. KẾT LUẬN

- Trong 08 đột biến nghiên cứu, alen đột biến CD17(AAG-TAG) và CD41/42(-TCTT) gặp với tần suất cao nhất : 41.6% và 34.7%. Đột biến CD71/72 được đưa vào sàng lọc bước 2 thay cho đột biến IVS1-5. Đột biến CD26 của HbE gặp với tỷ lệ 12.5%.
- Tiến hành chẩn đoán trước sinh thành công cho 6 gia đình có tiền sử sinh con đầu mắc beta Thalassemia, trong đó 2 gia đình có thai mắc beta Thalassemia thể nặng, 4 gia đình có thai la người lành mang gen bệnh hoặc không mang đột biến trên gen Hbb.
- Việc xác định đột biến trên gen Hbb đóng vai trò quan trọng trong việc đưa ra tỷ lệ của các đột biến thường gặp, và là phương pháp duy nhất, nhanh chóng, có độ chính xác cao trong chẩn đoán trước sinh bệnh beta Thalassmia, góp phần giảm thiểu tỷ lệ sinh con mắc bệnh beta Thalassmia thể nặng, và nâng cao chất lượng dân số.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bùi Văn Viên, Dương Bá Trực, Nguyễn Công Khanh.1999. Nhận xét bước đầu cơ sở di truyền phân tử và mối quan hệ giữa kiểu gen với mức độ thiếu máu và thể tích hồng cầu trong bệnh HbE/b Thalassemia. Tạp chí Nhi khoa,8
2. Hoàng Văn Ngọc. 2007. Nghiên cứu thực trạng bệnh β thalassemia và một số yếu tố liên quan ở trẻ em dân tộc Tày và Dao tại huyện Định Hóa-tỉnh Thái Nguyên. Luận văn thạc sỹ
3. Nguyễn Công Khanh (1993). Tần suất bệnh hemoglobin ở Việt Nam. Y học Việt Nam,8:11-6.
4. Nguyễn Khắc Hân Hoan, Chẩn đoán di truyền phân tử bệnh beta thalassemia tại bệnh viện Từ Dũ.
5. Lê Thị Hảo. Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật di truyền phân tử phát hiện đột biến gen gây beta thalassemia tại Việt Nam.
6. Department of molecular and clinical genetics - Royal Prince Alfred Hospital - Australia. Beta thalassaemia protocols. 2005.
7. HH Jr Kazazian, CE Dowling, PG Waber, S Huang and WH Lo. 1986. The spectrum of beta-thalassemia genes in China and Southeast Asia. The American Society of Hematology 68: 964-966
8. Imran-ud-din Khattak, Sania Tanwwer Khattak, Jehanzeb Khan. 2006. Heterozygous beta thalassemia in patients of children with beta thalassemia major. Gomal Journal of Medical Sciences July-Dec 2006, Vol.4, No.2
9. M.L. Saovaros Svasti, Tran Minh Hieu, Thongperm munkongdee, Pranee Winichagoon, Tran Van Be, Tran Van Binh and Suthat Fucharoen. 2002. Molecular analysis of β-thalassemia in South Vietnam. American Journal of Hematology 71:85-88.
10. Prevetion of Thalassemias and other haemoglobin disorders, Vol.2, Published by Thalassemia International Federation.
11. R.A.Flavell, R.Bernards, J.M.Kooter and E.de Boer.1979. The structure of the human β-globin gene in β-thalassaemia. Nucleic Acids Research Volume 6 Number 8
12. S. L. Thein, P. Winichagoonj C. Hesketh, S. Best, S. Fucharoenj' P. Wasi and D. J. Weatherall.1990. The Molecular Basis of beta-Thalamia in Thailand: Application to Prenatal Diagnosis.Am. J. Hum. Genet. 47:369-375.